輸卵管::一個被外科丟棄的MSC新來源

使用幹細胞當再生性藥物的可能性已經開始被搜索,在搜尋有很大的興趣在於獲得可產生多種結果的幹細胞或經由非侵入性步驟取的的來源,我們已知MSC可由臍帶,牙根及脂肪組織,這些被丟棄的物質去分化成肌肉,脂肪,骨頭,軟骨組織.

而這研究則要區別,擴大及評估人類輸卵管(hFTs)的分化潛力。

hFTs lineages是擴大的,並有自己的染色組型分析.是由flow cytometry以體外檢測為脂肪形成的,軟骨形成的,成骨性的.或肌原性的分化。

hFTs是在婦產科手術中被丟棄的的,也是MSCs的另一豐富來源,也是我們所特定的人類輸卵管MSCs(htMSCs)

而在體外的試驗中也發現htMSCs可以容易的分離,增生,並表現出間質細胞的樣貌且可以在體外分別形成肌肉,脂肪,軟骨,及骨頭.

MSCs具有典型未分化可形成各種不同細胞的天賦,具有self-renewal能力,並有分化成各種不同細胞系的潛力.個體的各處器官有密切關係的供給與組織修複的相關組織中都可發現這先驅細胞!然而這些功能合成物的細胞表面接受器呈現,也是MSC從不同組織分離出來的,,如:骨髓,骨骼肌,肺,脂肪組織.牙根,胎盤,臍帶!

除了我們先前知道的MSCs的來源與其分化後的器官外.這特殊的增生能力在人類子宮內膜伴隨著經期,產後,手術(子宮刮除,子宮內膜刮除)及停經後婦女以荷爾蒙治療.都暗示MSCs在這些組織的呈現位置在這過程中是有責任的!

hFTs在胚胎學的來源上與子宮具相同功用.它們有能力在經期時間誘導內分泌的改變,包含細胞生長與增生,供給獨特的環境是必要的,為了來維持配偶子生存能力.受精.及早期胎兒發展能如同在子宮那麼好.這研究的目的在於探討來自Hfts的MSCS的獨立性,增生性,特性及分析其分化潛力.

方法::

輸卵管之收集與步驟

在婦女35-53歲期間,於接受外科手術(切除或結紮)前三個月為使用外來的荷爾蒙治療,每個樣本存放於添加10%FBS的DMEM/F-12或DMEM/High.保持在4℃,24小時!所有的樣本以PBS充洗兩次.以解剖刀切片放入falcon,以TripLE Express在水浴裡培養30分,37℃.然後,取出懸浮物在15ml的falcon以7mlDMEM/F-12加10%FBS沖洗一次,並以400g離心5分鐘.取出沉澱物接種在DMEM/F-12並添加其他物質,並每星期更換兩次!

   PD(Population Doubling)與染色體組型分析

     PD實驗帶出證實在最後5天細胞系統的生長速率,並以方法學來計算生長速

率.經由上述步驟後,以Giemsa染色來計算染色體計數,並以顯微鏡拍照.

流式細胞儀分析

流式細胞儀使用Guava EasyCyte微細管,以鐳射激發放射出488-532nm的波長偵測個別的細胞,細胞以PBS製成1.0× 10⁵ cells/Ml,染上抗體後置於室溫下暗室中45分鐘,細胞用PBS沖洗3次,再置入0.25ML的PBS成懸浮液.

為了分析表面呈現的典型蛋白質makers,附著細胞以下列之抗人類原始抗體

治療:: CD13 –PE, CD14, CD29-PE-Cy5, CD31-PE, CD34-PerCP, CD38- FITC, CD44-FITC, CD45-FITC, CD73-PE, CD90-R-PE, CD117-PE ,CD133-PE, HLA-ABC-FITC and HLA-DR-R-PE, SSEA4, STRO1, and SH2, SH3 and SH4.未聯結上的Makers則應對到 anti-mouse PE secondary antibody.

MSC分化

為評估MSC分化的性能,附著細胞在體外的脂肪形成的,軟骨形成的,成骨性的或肌原性的分化  過程符合以下各章節

脂肪性的分化

從hFTs來的增生細胞培養在添加1 μM dexamethasone, 500 μM 3-isobutyl-1-methylxanthine, 60 μM indomethacin, and 5 μg/mL insulin 的增殖medium.並證實在脂肪形成的分化第21天可獲得可被oil rde O染上色的富含脂質的空泡.

軟骨性的分化

2.5 × 10⁵ hFTs置於15 mL polystyrene tube以500g離心5分鐘,並用基礎medium置成10ml懸浮液.這The basal medium包含 DMEM/High 添加 1% ITS-Premix, 1% 10 mM dexamethasone, 1% 100 mM sodium pyruvate, and 1% 5 mM ascorbic acid-2 phosphate .去除了pellet後,細胞以chondrogenic differentiation medium0.5ml回置成懸浮液, 包含basal medium 添加10 ng/mL TGF- β1 及 10% FBS.並保持在37℃,5% CO2的溼度下.

第一天,緩慢的倒空以獲得一個單獨的飄浮細胞範圍.每3-4天更換一次medium.第21天,細胞以10%福馬林固定24小時4℃.並埋入石蠟. 切成5 μm薄低切片再以 toluidine blue染色.來顯示細胞外母體黏多糖.

成骨性的分化

成骨性的分化是將hFTs細胞培養在DMEM/LG;添加 0.1 mM dexamethasone 和 50 mM ascorbic acid-2 phosphate的培養基所獲得. 並保持在37℃,5% CO2的溼度下,第10天, 加入10 mM β-glycerolphosphate促使礦化,在第21天,成骨化分化以calcium-hydroxyapatite-positive areas型式呈現,經過兩次PBS及1次蒸餾水後,細胞培養於1% silver nitrate並於紫外燈下照射45分鐘.之後培育在3% sodium thiosulfate5分鐘,並用Van Gieson複染,而鈣聚集則顯示為暗色.

肌原性分化

肌原性的分化是將hFTs細胞培養在myogenic differentiation medium (由 50% induction medium 和50% fresh DMEM/F-12 添加 10% FBS 所組成並保持在37℃,5% CO2的溼度下.

Proliferation medium, 由 DMEM/F-12 添加10% FBS, 100 IU/mL penicillin和100 IU/mL streptomycin所組成,而這相同的medium先前被使用於培養 primary human myoblasts 48小時.使用前 induction medium 先以0.22 μm的過濾膜過濾.而PH值以重碳酸鈉調整. hFTs MSCs培養40天並每星期更換兩次,在這間隔後,細胞以免疫螢光及西方墨點法檢測.

免疫螢光分析法

免疫螢光分析法測定肌營養不良蛋白是被用來準備確認muscle-differentiated hFTs細胞的肌原性分化.細胞以冷PBS充洗2次, 4% PFA/PBS 20 分鐘4°C固定後,  0.05% Triton X-100加入PBS permeabilized  5分鐘. 10% FBS/PBS在室溫下進行非特異性結合1小時後,添加 primary antibody (anti-dystrophin; Ab15277; Abcam)置於4℃ overnight.然後在加入 secondary antibody (FITC IgG; Chemicon)於室溫下一小時,核仁以複染劑DAPI染色, 我們使正常人類的differentiated myotubes cultures為陽性對照組. 使用non-diferentiated htMSCs為陰性對照組. 用Axiovert 200顯微鏡觀查檢測的免疫螢光染片 .

西方墨點法

hFTs 的肌肉分化型蛋白質被萃取出後以添加10 mM Tris-HCL [pH 8.0], 150 mM Nacl, 5 mM EDTA, 1% TX-100,和 60 mM octyl glucoside 的緩衝液來治療.

樣本於13000g離心10分去移除不能溶解的物質，利用SDS-PAGE 6%分開蛋白質,並轉移到nitrocellulose membranes上.所有的membranes都染上0.2% Ponceau S來評估蛋白質的數量, membranes在室溫下以TBST加5% MILK,再加入anti-dystrophin (VP-D508)及anti-skeletal myosin (M7523) primary antibodies Overnight .接下來, membranes  結合peroxidase-conjugated anti-mouse 和 anti-rabbit IgG secondary antibodies在室溫下一小時. 以Enhanced Chemoluminescence Detection System來檢測免疫反應性的鍵結.

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結果

  Lineages Expansion, Population Doubling (PD) and Karyotype analysis

以電解法分離hFTs後，大部份的形態是紡錘狀,類似於纖維母細胞,一些細胞以內皮的相貌呈現聚集,緩慢的流動.也能被觀察到.在第一次的酵素分離後,5-7天的培養期間附著細胞由含有MSC-like phenotype的同質細胞層組成,所有的係譜都增大,冷凍,解凍數次,PD檢測顯示高速率的細胞分裂.而Karyotype analysis顯示沒有發現異常染色體.

流式細胞儀

從hFTs獲得的附著細胞不表現hematopoietic lineage markers (CD34, CD38, CD45, CD117 and CD133), endothelial marker CD31和monocyte marker (CD14).

另外,大部份的細胞表現高量的adhesion markers (CD29, CD44 and CD90) 和 MSCs markers (CD13, CD73, SH2, SH3 and SH4). 從hFTs獲得的獨立細胞可從HLA-class I取得,但HLA-class II則無,為了做實驗比較,我們提供了流式細胞儀在freshly digested and not cultured hFTs.,我們使用9個mesenchymal stem cells markers (CD13, CD29, CD44, CD73, CD90, Stro-1, SH2, SH3 and SH4),就如同tissue specific markers (CD14, CD31 and CD34).流式細胞儀總結了hFTs細胞的間質細胞樣貌,由結果得知,CD29.CD44.都出現在htMSC及freshly digested and not cultured hFTs.

Multilineage Differentiation

從hFTs來的附著細胞其可塑性是在中胚層各別分化為成骨性,脂肪性,軟骨性三星期後評估,這多樣性分化是從5個單獨的lineages of htMSCs進行,而且之間分化能力沒有明顯的不同,此外,hFTs分化成骨骼肌細胞的潛力在培養於medium40天後被考證.成肌性分化藉由myogenic markers(myosin和dysprosin)的表現來顯示.hFTs於體外分化成肌原性, 脂肪性,軟骨性及成骨性.這結果確信了獨立細胞的間質細胞天性與他們的多潛能性.

DISCUSSION

這使用幹細胞作增加藥物的可能性已經有一新的搜尋來獲得最好的MSC來源,以非侵略性的步驟.

初步確定如同骨髓的前驅物,新的憑證表示MSCs出現在所有的器官.並在組織保留與增生扮演一個重要的角色.最近,也在人類子宮內膜和經血發現.同樣在體內展現出增生能力,一個最近的研究顯示isolating stem cell來自子宮內膜並促進體外的軟骨形成.

MSCs已被發現存在於臍血,牙根,脂肪組織,經血及生物廢棄物,都可以分化成為肌肉,脂肪,骨頭及軟骨細胞系列.這些由外科手術所丟棄的hFTs是含有豐富MSCs的來源,我們稱做htMSCs.早期的htMSCs片段須要約莫15小時的PD時間.然而,添加其他片段後,PD時間縮短且穩定,且其染色體在片段裡也呈現穩定狀態.

純化的 Stro-1-enriched補充了異體移植的抑制作用,而異體子宮內膜的增生細胞(ERC或經血幹細胞),是Stro1 negative.另一方面,CD44是在傷口位置組織增生石出現的MSCs marker, 而在htMSCs及fresh digested fallopian tube tissue都有高度表現,CD29，一個 integrin.與附著細胞關係密切,也在所有htMSCs大量增生.

HtMSCs在殘孩再生上扮演一個重要角色 ,不管如何,高量的adhesion markers (CD29, CD44 and CD90) 及其他 MSC markers (CD13, CD73, SH2, SH3 and SH4) 一起與多樣性分化確信了獨立細胞的間質細胞天性與他們的多潛能性.

這些結果也顯示htMSCs快速擴大的能力具有在臨床上應用的潛力.

這些輸卵管上皮細胞的型態上與功能上在受精卵生長的微小環境及胚胎早期發展的演化過程扮演相當重要的角色.就如同最近報導人類輸卵管細胞在co-culture改良了胚胎型態學,培植速率,及懷孕成功!

hFTs以解剖學方式獲得四個片段(intramural, isthmic, ampulla, and infundibulum/fimbria)每個都包含不同上皮細胞,和明顯的分泌活動,細菌和病毒經常在陰道內被發現可能零落的進入上述的生殖管道分裂hFTs的上皮細胞完整,也意味著對女性的生殖健康有意義的危險因子.

我們藉由體外子宮內膜基質細胞總數感應軟骨的分化就能顯示出endometrial multipotent cells的存在，然而, 使用婦科的非子宮內膜組織如myometrium, fallopian tube, and uterosacral ligaments當作對照組,他們是不能顯現軟骨生成的.這意味著較少的progenitor stem cells在這些組織和子宮內膜相比較它們在終生增生上有較低負荷,或者這分化分析法並不適用於這些組織.而以我們成功獲得從htMSCs上的myogenic, adipogenic, osteogenic,與chondrogenic分化為基礎

我們假設輸卵管組織沒有軟骨形成的能力,那改變相關的方法會比改變progenitor stem cell濃度來的好.

結論

常規子宮切除手術後的輸卵管可能成為間質幹細胞的另一個來源.
　　巴西聖保羅大學人類基因組研究中心的科研人員表示:科學家已經從臍帶、牙髓和脂肪組織中找到可以發展成為肌肉、脂肪、骨骼和軟骨組織的幹細胞.這些被稱為"生物遺棄"的幹細胞來源不存在倫理問題.輸卵管正是在手術過程中遺留的人類組織碎片.巴西研究人員對至少近3個月未接受激素治療的婦女的輸卵管進行研究,她們的年齡分佈為35-55歲.從輸卵管中獲取的間質幹細胞很容易在分化成其他組織細胞,而且不會形成異常染色體,這表明他們有良好的染色體穩定性.這一發現可能為再生醫學再添一種新的幹細胞來源.