黑殭菌液態量產技術之研發 ________________________________________ 高雄區農業改良場　曾敏南 一、研究背景 　　黑殭菌(Metarhizium anisopliae)為一種對昆蟲具有致病能力之昆蟲寄生性真菌，亦稱為昆蟲病原真菌(entomopathogenic fungi)。當昆蟲體表接觸到黑殭菌之分生孢子或菌絲時，黑殭菌之分生孢子可產生侵染構造及昆蟲體壁之分解酵素，繼而穿透昆蟲體表進入昆蟲體內生長、殖據，最後導致昆蟲死亡。由於黑殭菌可侵染許多昆蟲，其中亦不乏重要之衛生昆蟲及農業害蟲，例如蟑螂、小菜蛾及金龜之幼蟲，並具有良好之致病能力，因此具有發展成為生物農藥的潛力。然而限於量產之方法及自然界逆境的限制而少有商品上市，因此農友也難以獲得相關產品實際應用於防治工作。不論何種生物防治法，生產大量優良品質的防治媒介是首要且必需的工作，也唯有如此才有可能成功的達到防治工作。黑殭菌對害蟲之致病力及田間實際防治工作上已有為數眾多之研究，並證實黑殭菌具有良好之效果，唯黑殭菌受環境逆境、量產及保存方面之瓶頸而有推廣上的困難，且這種情況在其它用來作為生物防治的微生物製劑上亦普遍存在。黑殭菌目前雖可經由固態發酵之方式成功的獲得大量分生孢子，但採用固態發酵之方法需要大量的空間及容積用來進行生產工作，且採收分生孢子時容易粉塵飛揚，造成工作人員之不適。基於上述原因，發展液態培養來量產黑殭菌或許為一可行之方法。 二、擬解決問題 　　黑殭菌在一般液態培養之環境下可能只產生大量菌絲及芽孢，而所獲得之芽孢雖可運用於生物防治之工作中，但由於芽孢在保存上可能更不利於分生孢子，因此利用液態培養生產分生孢子之經濟效益，可能更高於利用固態生產之方式，故發展液態環境生產分生孢子之技術，或許可改善上述缺點，並達到更佳的經濟效益。Penicillium oxalicum、P. cyclopium、P. notatum 以及Ulocladium atrum被用於植物病害之生物防治媒介，目前已有報告指出上述菌株可利用液態培養來生產分生孢子。近幾年亦有報告指出Metarhizium flavoviride可藉由誘導之方式在液態環境下產生分生孢子，故本場嘗試利用液態培養基之水勢 (water potential) 調整及不同濃度之氯化鈣 (CaCl2) 的添加來誘導液態培養狀態下產生分生孢子，以期能利用更簡單快速的方式進行黑殭菌分生孢子之量產。 三、黑殭菌於液態環境產孢之研究 　　利用氯化鈣及水勢調整的方式在搖瓶試驗中，於液態培養條件下誘導出分生孢子，經觀察黑殭菌分生孢子形態後，發現經液態培養後可產生兩種形態之分生孢子，其一為短楕圓形，長寬約4.7×2.8μm(圖1)；另一為長楕圓形，長寬約9.3×2.2μm(圖2A)；短楕圓形孢子著生於菌絲側邊所產生之短柄上。長楕圓形孢子則著生於菌絲未端所產生之瓶梗構造上(圖2B)，與氣生組織所產生者相同，分生孢子著生於分生孢子梗未端。該兩者構造中，分生孢子梗只發現於添加氯化鈣之培養條件者，而未添加氯化鈣者只產生短柄著生分生孢子。 　　研究顯示添加氯化鈣於MEB培養基中可明顯提高黑殭菌分生孢子之產量(約4.8×106 conidia/ml)，然而將氯化鈣添加於經過調整水勢(-2.1 Mpa)之液態培養基中，確明顯抑制產量，猜測其原因可能是菌株對PEG 200敏感性較高，使得PEG 200對黑殭菌產生毒害所造成。因此將水勢調整媒介以甘油替代進行試驗，以甘油進行水勢調整後，可明顯提高搖瓶試驗之產量約為1.3×107 conidia/ml。 　　此外，將搖瓶試驗之結果轉移至7公升之小型醱酵設備上應用後，已確認將容量放大到5公升時，亦可順利的誘導出分生孢子，濃度約為105~106 conidia/ml左右。 　　另外再以市售白米培養黑殭菌之產孢量與液態培養 (添加氯化鈣) 之產孢量相比較，在短時間內以液態培養所產生之產孢量較高，液態培養5天後孢子濃度已達106 conidia/ml 以上，固態培養第7天孢子濃度為3.12×105 conidia/ml，但固態培養的時間如果增長則產孢量可持續增加，在培養第14天時已達到108 (cinidia/ml)以上。李、候 (1989年) 報告指出以糙米培養黑殭菌54天，可獲得1010 conidia/ml以上的產孢量。但整體而言，以液態培養可在較短時間比固態培養獲得更大量的孢子。 四、未來展望 　　由於近年民眾對於安全蔬果之認同與需求逐漸增加，因此吉園圃安全認證甚至是有機蔬果之需求也逐漸具有穩定的市場。然而有機蔬菜之種植完全需仰賴生物及物理防治方法，而目前對於害蟲之防治技術當中，雖有部分非農藥防治技術，利如：利用性費洛蒙誘殺害蟲 (如斜紋夜蛾及甜菜夜蛾) 、利用誘引性物質誘殺 (如東方果實蠅) 及蘇利菌等，但是仍不足以滿足有機栽培之害蟲防治所需。因此，筆者相信在未來微生物防治劑在往後必定有其需求值得吾人加緊進行研究開發。