實驗材料與藥品：

材料：

1. 新的手套，新的口罩！（重要）

2. 自製小塑膠袋（用滅菌袋＋封口機做的）大小約 4 x 15

3. RNA 區的 pipetman

4. RNA 區的 Filter tip

藥品：

1. Trizol （Invitrogen（紅色）或是 BioMan（藍色），用買的）（1 cc / sample ）

2. DEPC treated ddH₂O （買的或自己配，DEPC有劇毒，滅菌後會分解）（400 μl / sample）

3. Chloroform : EtOH = 24 : 1 （在RNA區，懸空用倒的避免污染）（200 μl / sample）

4. Isopropanol （一般買來的）（500 μl / sample）

5. Ice colded 70~75% 和 95%~100% EtOH （DEPC treated ddH₂O 配製）（1 cc / sample ）

6. 4% H₂O₂（可以殺RNase）

實驗前準備：

當天

1. 拿液態氮。

2. 大的冰桶。

3. 自製的小塑膠袋。

4. 拿自己的小袋子裝Trizol tip、Trizol Eppnedorf還有自製小塑膠袋。

4. RNA區有 filter 的 tip。

5. 自己滅菌新的且標記好的Eppendorf 組織數 x 5（T、W、I、S、M）。
（Ｔ）： 空的，磨完Tissue裝Trizol用
（Ｗ）：預先加入 300 μl DEPC treated ddH₂O，Trizol濾去雜質後
（Ｉ）：預先加入500 μl isopropanol，chloroform分離後
（Ｓ）：空的，儲存用
（Ｍ）：空的，測量用

6. 分裝好的DEPC treated ddH2O

7. 預冷離心機到4℃。

8. 裝好10 ml 4%雙氧水的 15 ml 離心管。

9. 在抽氣櫃鋪上一層無塵紙。

10. 分裝 Chloroform : EtOH = 24 : 1，每 20 個 sample 分裝 5 cc 到 50 cc 離心管。（用倒的避免污染）

實驗流程：

收取組織（當天 or 好幾天前）

1. 取下組織後，放入Eppemdorf，以液態氮急凍，之後冰到-80℃冰箱。

Trizol研磨組織

1. 於-80℃取出要使用的組織，將所有Eppendorf放到厚的塑膠袋中，再整個放到液態氮中。

2. 每次倒出一個Eppendorf的組織，到自製的小塑膠袋中。

3. 加入1cc Trizol並以rack研磨自製小塑膠袋中的組織。

4. 抽出Trizol到原本裝Sample的Eppendorf ，置於冰上。

4-1. 若是脂肪組織，置於加熱器上，37℃ 600 rpm 10 min。
（600 rpm 是那台機器的建議值，過高怕壞掉）

5. 離心 9000 rpm, 4 ℃, 10 min。（此時會有殘渣在底部，脂肪組織還會有油脂跟結締組織在表面）

5-1. 若是脂肪組織，先撥開表面的殘渣，到中間層吸取 800 μl Trizol到新Eppendorf（Ｔ），（ tip 離開時要刮掉周圍的殘留組織）再離心一次。

（Liver與WAT的比較，磨Liver的Trizol會比較偏向深紅色）

6. 取 700μl 上層的Trizol 到到裝有 200 μl 的Eppendorf （Ｗ），上下翻轉混合。
（剩餘的Trizol要吸到Trizol專用廢液桶，Eppendorf置於抽氣櫃內風乾）

RNA 萃取（此部份將沒有Trizol保護，要避免污染）

1. 每一管各加入 200 μl chloroform，上下翻轉混合，置於室溫 3 min。
（避免vortex，gDNA會斷，混進RNA）

2. 離心 15000 rpm, 4℃, 10 min。

3. 取 80% 的上清液（約500 μl）到預先裝有 500 μl isopropanol 的Eppendorf（Ｉ）中，上下翻轉混合，置於室溫 10 min。（千萬別取到中間白色的Protein與下層的Trizol。）

5. 離心 15000 rpm , 4℃, 10 min，此時底部會有白色或透明的 RNA pellet，沒有也要繼續做。
（這步驟要將pellet強力固定在eppendorf底部，固定Eppendorf方向，開口朝圓心，pellet會在另一方向）

6. 輕輕倒出上清液（要一次倒出，避免液體殘留），加入1 cc Ice colded 75% 酒精 （DEPC treaed ddH₂O配製，習慣先放在 4℃ 比較冰），上下翻轉混合清洗pellet。

7. 重複步驟 5 和 6，但改用95%或100% ice colded 酒精。（此步驟可幫助脂肪組織RNA去除油脂）

8. 離心 15000 rpm , 4℃, 10 min。
（這步驟要將pellet強力固定在eppendorf底部，固定Eppendorf方向，開口朝圓心）

9. 先用1cc filter tip 吸出酒精，再用 200 μl tip 吸出殘留的酒精。
（注意：不要碰到 pellet 離心下來的固定位置）

10. 於加熱器 56℃ 乾燥 RNA 約1~5分鐘（乾燥過久會降低 pellet 的水溶性，也增加污染風險）。

11. 以 適量 DEPC treaed ddH₂O 回溶 RNA。（看不到pellet用20，一點點用30，中量用70，大量用100）

11-1. 離心 15000 rpm , 4℃, 10 min。
（此步驟視情況使用，可去除沒回溶的pellet，可能難溶，也可能是Protein，可能干擾濃度與純度）

12. 抽出 （回溶體積-5）μl RNA 到新Eppendorf（Ｓ）儲存用，剩下 5 μl RNA 到另一個Eppendorf（Ｍ）確認濃度與品質（回溶狀況好的話，用原本的（Ｉ）也可以）。

13. 測完濃度後，以DEPC treated ddH₂O 調整濃度，使每一管濃度一致，然後分裝。
（For RT PCR 建議濃度用 0.125 μg / μl）

（以RNA狀態儲存於-80℃只能放約兩個月～半年，視情況轉成cDNA存放）

14. 跑膠確認 16s, 28s RNA（真核生物）的狀況。



特別注意事項：

1. DNase的使用，可以增加RNA的品質，但是Trizol法一般沒在用，通常是Kit在用。

2. 跑膠可能有4條 band，分別是最上面的gDNA、28S、18S、5S

3. 從28S、18S的比例，可以看出有沒有degrade的現象，一般來說要1：1

4. 用 4% 雙氧水噴手套，然後用擦手紙擦乾，有沒有殺RNase的效果我不確定，做心安的XD

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資料來源