限制性定点依赖PCR：

一种高效快速克隆新微生物基因的技术

摘要：

关键词： 简并引物，  PCR，新基因克隆

1、         简介

来自各种各样的微生物的生物活性蛋白已经越来越有吸引力，它对于化学制剂和医药中间体的常规催化剂具有可替代性。然而，现在可用的蛋白质的质量并不总是能满足严格的应用标准。定向进化是适应一种生物活性蛋白的特点的强有力的工具，但是，进化差异的筛选一直是瓶颈所在。为了满足各种工业和配药肽、蛋白质、酶对其不断提升的要求，  新的基因和蛋白质需要从大量的微生物中筛选出来。因此，现在的问题聚集寻求在相关基因的高效快速的筛选方法。然而，传统的基因克隆是一个冗长而耗费时间的工作，这个工作通常要求构建和筛选一个文库，而且，紧密的工作不一定能够保证克隆的成功。要求的步骤包括：探针的标记、合适的酶切、southern杂交，这其次是对一个基因文库的构建和筛选。

PCR反应已经把DNA片段扩增应用于分子克隆，这在利用RT-PCR技术克隆cDNA的过程中特别有效。DNA聚合过程中，短寡核苷酸引物序列必须可以退火，这是PCR技术的核心。在多数情况下，当利用PCR技术克隆一个新基因或者设计DNA片段时，信息的缺少会引发一些问题，因为在目标DNA的另一个末端的序列是不知道的。RT-PCR技术的成功依赖于一个通用引物对mRNA  PolyA尾的补充，这结合了一个已知序列的特异性引物。

PCR技术利用多种原理来获得有效的通用引物来对一个未知的DNA片段的染色体进行复制，它分为三种类型：反向PCR、联合媒介PCR、自由引物PCR。总得来说，现金的染色体复制的PCR技术遭到一下几方面的限制：(i)他们面临着整个基因组的高复杂性以及操作的高精密度；(ii)容易引进受污染的产物；(iii)很少一部分能适用于利用基于氨基酸序列或者保守的基因位点的简并引物的新基因克隆。因此，PCR技术通常和传统克隆技术结合起来一起使用，例如文库构建、探针标签、southern杂交等等。

我们在这里介绍的是一个简单而有效的PCR技术,RSD-PCR技术。这个技术利用DNA基因组中的自然限制性位点来设计一个通用引物，它利用一个没有嵌套进程的两轮PCR方法。优化过的RSD-PCR技术通过简并引物成功应用于染色体组的复制和新基因的克隆。

2、         材料和原理

2.1 细胞培养和基因组DNA的提取

嗜热厌氧乙醇菌JW200（Thermoanaerobacter ethanolicus JW200）,  海栖热袍菌（Thermotoga maritima）和粟酒裂殖酵母YHL6403（Schizosaccharomyces pombe YHL6403）的染色体DNA来自于Dr J. Wiegel 和 Dr M. Adams (美国乔治亚大学) 和 Dr Ying Huang (南京师范大学).短小芽孢杆菌ARA（Bacillus pumilus ARA)在实验室提纯，并且保存在50^.C的液态环境中。液态培养基中含有：1.5%木聚糖、0.3% K₂HPO₄、0.2%酵母提取液。大肠杆菌JM109（Escherichia coli JM109）及其重组子在37^.C下的LB培养基中有氧培养。从大肠杆菌细胞或琼脂糖凝胶中，质粒或DNA片段给予用质粒纯化的试剂盒，或QIAquick凝胶提取试剂盒被分别提纯出来。

2.2新型阿拉伯糖苷酶（arabinosidase）氨基酸序列的获得

    阿拉伯糖苷酶（arabinosidase）的活性在60^。C用标准程序测得。蛋白质的浓度用布拉德福特法，以牛血清白蛋白为基准测得。同时，阿拉伯糖苷酶用无水硫酸铵、DEAE-Sephacel试剂、Butyl HIC试剂和HW-55F-toyopearl色谱（sigma）部分纯化。在阿拉伯糖苷酶原梯度凝胶电泳主要频带上的蛋白质被转移到聚偏二氟乙烯膜上，这种转移是通过给氨基末端氨基酸序列带上电印记实现的。

2.3设计一个RSD-PCR试验方法和一系列RSD引物

    为了减少非特异性扩增，RSD-PCR设计了两轮循环。在第一轮循环中，基因组DNA中的单链靶基因在严格的条件控制下进行扩增，整个过程由单一的特异性引物介导。稀释50倍之后的第一轮PCR反应混合物用作第二轮PCR反应的样板。这样，双链靶基因就扩增完成了，整个过程利用了一个简并引物，并且在第一轮反应中利用了特异性引物。整个反应的温度Tm可以用一下公式计算得到：Tm=4×(G+C)+2×(A+T)。

简并引物是一系列基于限制性位点设计的RSD引物，常被用于多位点克隆的载体。这个载体包含一个一个选择性限制位点的3’端补充，和一个简并核苷酸序列的5’端     支持引物在那个温度下的退火。从高度简并的基质中清除掉适量RSD引物的5’端的补充基质，以此来降低合成引物二聚体时的温度，并且确保每个引物二聚体的末端有至少三个基质没有得到补充。现在，由于限制性内切酶序列的特异性，没有一个公式能作用于这种引物设计方法。     

表1中的引物 人工设计 修复引物序列 反向平行 所有可能的位置

当在限制性位点存在G或C时，用这种方法，聚合一个引物二聚体的温度比聚合一个混合模板引物的温度至少要低8C，这样一来，在PCR过程中，大多数引物二聚体在严格的退火温度就能够变性。

2.4设计和优化RSD—PCR

海栖热袍菌（T. maritima）的醋酸激酶基因ak被用作样本基因来优化RSD—PCR过程。基因特异性引物ak补充了在醋酸激酶基因（ak）的终止子的附近区域，这个过程是根据ＮＣＢＩ的在线序列（表１）设计的。在第一轮ＰＣＲ的４０个循环中， 50 微升Taq-DNA聚合酶前体缓冲液包含了1.25微Taq-DNA聚合酶前体(TaKaRa)和dATP, dTTP, dCTP,和dGTP各2.5毫摩尔。在第一轮PCR中，测试不同数量的基因组DNA模板，优化退火温度旨在最优化实验方案。在第二轮PCR中，PCR的条件通过优化RSD—引物浓度、第二轮的退火温度以及在第一轮PCR中扩增的单链模板数量来得到优化。优化的RSD—PCR循环条件 on PTC-

200 Peltier Thermal Cycler (MJ Research)设计成入成如下：第一轮循环40次（94^. C,30S；54^. C，30S；72^. C，2min），第二轮循环35次（94^. C,30S；48^. C，30S；72^. C，2min）。

PCR产物通过DNA markers (TaKaRa)的凝胶电泳分割.从琼脂糖凝胶上分离出单链的DNA碎片被固定到pMD19T (TaKaRa)，然后用GenePulser Xcell (Bio-Rad)转化到E. coli JM109细胞中。阳性克隆用LB -氨苄青霉素（ 100毫克/毫升）平板来筛选，并用采用M13正向和反向引物（表1 ）的PCR来确认菌落。为了决定插入DNA的序列，我们从基因中分离出重组质粒，并且用Invitrogen公司的双脱氧链终止法进行测序。

2.5特异性简并引物的选择性扩增

为了从短小芽孢杆菌ARA中克隆新阿拉伯糖苷酶基因，简并引物是基于氨基酸序列合成的。按照表1设计了araN1, araN2,和raN3，构成氨基酸序列NGTVKV，根据氨基酸序列NGTVKV推断出的基因在引物退火时形成互补序列，从而合成3个低聚核苷酸。这是为了与3’端起始的第三个碱基的简并引起的特异性扩增作对比。在第一轮PCR（50微升）中，0.2微摩尔惰性araN1, araN2,或者0.4微摩尔araN3用于相应的反应中。在第二轮PCR中，用了4微升araN1, araN2或者8微升araN3。其他参数和优化过的RSD—PCR法一样（Fig。2A）

2.6利用RSD—PCR技术的基因克隆

为了寻找新克隆的阿拉伯糖苷酶基因, abfB of B. pumilus ARA的启动子 

起始密码子是根据表1中的部分序列设计的

根据T. psedoethanolicus 39E中adhB的序列设计特异性引物adh-N 和 adh-C (表1) 来把adhB加到其中。在每个引物中分别引入EcoRI和XhoI的限制性位点，以方便的对克隆到表达载体pET20b中的基因测序。根据从克隆的基因碎片中获得的内在基因，步行引物adh-up 和adh-down 设计成（表1）的序列。根据NCBI 在线序列 (accession no. Z9926)来设计一个粟酒裂殖酵母（S. pombe）中acetyl-CoA carboxylase gene (cut6)靠近起始密码子的特异性引物CUT（表1）

3.结果和讨论

3.1RSD—PCR方案的设计和优化

RSD—PCR方案包括以下几步：(i)设计并合成一个特异性引物和一系列通用RSD—引物；(ii)利用可变性的特异性引物从基因组DNA中扩增目标模板；(iii)利用特异性引物和其中一种特异性引物，从稀释的模板中扩增目标基因(Fig. 1).

在设计表1中的RSD—引物之前，测试了另一种通用的肌苷引物。测试的结果显示，肌苷碱基和核苷酸碱基中的11对并不足以支撑扩增时引物的退火。有种基因在草菇中编码大多数丰富的外周蛋白，当使用肌苷引物来克隆这个基因时，扩增发什么在相同的特异性引物之间。这可能是因为肌苷引物在退火时要求的温度太低了，或者在延伸的温度时就聚合了。同样的片段，在利用Z Taq-DNA聚合酶(Takara)时，退火温度低于38^。C ，延伸温度低于60^。C都能顺利扩增。因此，RSD-引物被证实是有效的。它结合一种特异性引物共同作用于RSD-PCR，一次来扩增新的DNA片段。根据已经报道的海栖热袍菌（T. maritima）中AK基因的克隆， 这个反应的条件可以进一步优化。用AK和RSD-引物已经扩增了~1.7和 2.7 kp[QJ1] ：Nco-dep和EcoR-dep (Fig. 2A-a and b) respectively，whereas _0.3 and 1 kb were yielded from Hind-dep (Fig. 2A-c).5个PCR参数测试用于RSD-PCR，最佳结果从以下几个实验获得：（i）针对海栖热袍菌（T. maritima）基因组DNA目标模板扩增的第一轮PCR反应中，500 ng / 50 微升反应混合物 (Fig. 2A, lane 1–3)；

（ii）10^.C above T_m for T_a^1st (Fig. 2A, lane 4–7)；

（iii）目标模板稀释20-50倍，具体数据不详；

（iv）40^．C to 48^。C of T_a ^2nd (Fig. 2A, lane 8–10)；

（v）第二轮PCR要4微摩尔或者更高浓度的RSD引物；

   图2A的指定片段经克隆和排序过后，被证实和在线公布(accession no. NC_000853).的是一样的。然而，EcoR-dep 引物 annealed to [QJ2] the EcoRI(GAATTC) 在目标基因中的相似位点 GAACTC，whereas the other RSD-引物 annealed to 相应的酶切位点(Fig. 3).  通过使用RSD-PCR从真核生物基因组粟酒裂殖酵母（S. pombe）扩增出cut6。这个过程中使 用特异性引物CUT6和通用引物Hind-dep, EcoR-dep, or Kpn-dep (Fig. 2B-a)。三个频段的测序结果表明，每个PCR片段的序列都和网上公布的序列(accession no. Z99261)一致，RSD-引物annealed to相应的限制位点(Fig. 3)

3.2利用简并引物进行新基因克隆

来自于短小芽孢杆菌ARA（B. pumilus ARA）的阿拉伯糖苷酶，它经过纯化，其第15个氨基端氨基酸序列是MNGTVKVNENIGRIS。根据NGTVKV (Table 1, araN1, araN2,and araN3)设计出简并引物。发生在从3’端开始的第三个碱基上的变性是获得特异性扩增的关键(Fig. 2B-b) 。当这个位置没有发生变性时，和第三个碱基互补的引物(araN1)产生的片段只有一个大小(Fig. 2B-b, lane 4), 和第三个碱基不互补的引物(araN2) 会生成许多无用的片段[QJ3] (Fig. 2B-b, lane 5)；当既有互补的引物又有不互补的引物(araN3)的时候，PCR产物则含有所有的杂质(Fig. 2B-b,lane 6) 。当我们从草菇中克隆新基因的时候可以看到相同的现象。随后，对用araN1 和 Pst-dep在单一频段[QJ4] (Fig. 2B-b, lane 4)上扩增得到的片段进行了测序，结果表明，这是一个潜在的阿拉伯糖苷酶基因，它和从B. substilus 168中得到的abfB有高度的同源性，而后者已经通过NCBI Blast的分析认证。特异性上游步行引物[QJ5] 是abfB设计的，两者居于一定的相似性。主要的0.5kb的片段，用 ara-up和Hind-dep (Fig. 2B-b, lane 7)从短小芽孢杆菌ARA（B. pumilus ARA）扩增得到。克隆完之后进行测序，显示，和abfB完全相似，并且获得了2.2kb的regutory核苷酸[QJ6] 序列片段(accession no. DQ324528)。

3.3 研究嗜热厌氧乙醇菌JW200中adhB的基因结构

一段1.2kb的adhB基因是从嗜热厌氧乙醇菌JW200（T. ethanolicus JW200）的基因组DNA中扩增得到的，这个过程用adh-N和adh-C作为引物。根据这个序列，为利用RSD-PCR克隆侧翼基因设计了不行引物adh-up和adh-down.为了测序分别用adh-up和EcoR-dep (Fig. 2B-c, lane 8)扩增了0.5kb上游步行产物，用adh-down和NcoR-dep (Fig. 2B-c, lane 8)扩增了0.9kb下游步行产物。AdhB的可能参数确定为RBS上游的70–100 bp。在adhB相反方向上游的切头ORF[QJ7] 被转化成含有93%氨基酸序列的多肽和76% of identity with the N-acetylglutamate-gammasemialdehyde dehydrogenase (argC) of T. psedoethanolicus 39E and T. tengcongensis MB4。用RSD-PCR完成更进一步的上游工作，以获得完整的argC 中的ORF。

从下游序列开始，切头ORF[QJ8] 在T. psedoethanolicus 39E和T. tengcongensis MB4 adhB下游的基因相似，它们是2-polyprenylphenol羟化酶和相关的黄素氧还蛋白氧化还原酶[QJ9] 。因此，获得了一下级段序列：完整的adhB中的ORF和上游的argC，还有一段3 kb的基因序列，这是T. ethanolicus JW200基因组DNA中切头的下游基因序列(accession no. DQ323135)。并且，把这些基因的结构和Thermoanaerobacter (Fig. 4)中这样种类的基因结构作对比。

3.4 退火引物中的通用引物

除了，尝试减少退火的次数，还有，依据有些种类中密码子使用的报导统计，没有直接的数据表明怎样根据一些氨基酸残基设计简并引物。具体的PCR扩增简并引物对阿拉伯糖苷酶基因

具体PCR扩增过程中有一些不同。这些不同显示araN3（对从3’端起始的第三个碱基  既有互补的片段又有不互补的片段混合物）会改变PCR的形式，而不是产生混合片段（利用araN1和araN2 (Fig. 2B-b,lanes 4–6)作为引物生成的）。这个结果说明：一方面，防止特异性引物3’端最后5个碱基的变性很重要；另一方面，3’端5个或更多的互补碱基后面紧跟着简并序列，这些序列能简化特异性扩增的选择。因此，RSD-PCR中使用的通用引物是这样设计的,利用能被限制性酶识别的六个核苷酸和11个简并[QJ10] 碱基。在这个引物中简并碱基的增多会降低特异性。虽然，理论上，HindIII和EcoRI在反应中起到很好的作用，但是富含G/C的限制性位点是更好的选择。在3’端，可以有5-8个碱基没有变性，但是，6个核苷酸限制性位点很容易被识别，反之，4个核苷酸限制性位点可能过于频繁的限制基因组中步移长度。

因此，为了配合通用引物，特异性引物的Tm被限制在42-48 ℃。通用引物的Tm是40-48℃(Fig. 2A, lane 8–10),在这个理想温度下，引物的Tm越高，其PCR产物将越复杂。因为从RSD-引物的变性[QJ11] 5’端清除的嘌呤和嘧啶可能和未知端互补，所以这增加了RSD-PCR扩增的不确定性。用这种方式降低引物二聚体融合的温度很有必要，因为常规碱基和肌苷结合的力量给退火提供的力量并不足够。

  3.5 RSD-PCR的总体策略

RSD-PCR的总体策略依据一下几个原则：

（i）限制性位点分散在双链DNA的整个基因组中，原核和真核生物的细胞都可用于自然通用引物的筛选；

（ii）简并引物是5’端和3’端的连接，这个5’端是支持退火的简并序列的5’端，这个3’端是有选择的修复基因组中有限制性位点的碱基的3’端；

（iii）再用特异性引物扩增目标模板之后，基因组DNA可以被大量稀释，这可以达到限制非特异性扩增的目的。

所以，我们在RSD-PCR过程中采用了2轮PCR扩增：第一轮，用特异性引物聚集特异性单链模板，并且依据基因组DNA扩增目标模板；第二轮，用特异性引物和一种通用引物来扩增目标基因。RSD-PCR在新基因的克隆中特别奏效.整个过程利用了基于氨基酸序列的简并引物或者保守区域，而不是按照嵌套式PCR、传统的文库构建和筛选的程序。除了文中列举的基因，RSD-PCR已经成功用于Candida sp.、Bacillus sp.和Alcaligenes sp.的染色体步移。然而，和RT-PCR一样，从草菇的染色体DNA中克隆新基因的过程中，RSD-PCR遇到了困难。这可能是由于机体本省的复杂性引起的。二轮的PCR在之前有过报导，在第二轮PCR之前就丰富了已知DNA单链序列的上下游。这个理论提升了最后的特殊性，但是，随后的自由引物扩增依然带来了非靶标分子。因此，更多基因步移的PCR方法在随后有了报导，利用嵌套式扩增来提高特异性。

3.6 RSD-PCR的实际操作

最终产物的特异性由第一条单链的扩增来控制。尽管在标准的PCR中，把Ta控制在10-15℃就可以获得特异性产物，但是，在RSD-PCR的第一轮反应中，Ta最好设置~10℃，并且高于Tm。染色体DNA的数量则决定于机体的基因组大小，细菌和酵母菌最好为~0.5和3微克。同时，没有变性的特异性引物的浓度英爱稀释为常规浓度（0.02微摩尔）的十分之一，因为，这影响扩增，而简并特异性引物的浓度会随着退火的进行而变化。例如，在从短小芽孢杆菌ARA（B. pumilus ARA）中克隆abfB的过程中，0.2微摩尔的简并特异性引物有很好的效果(Fig. 2B-b)。

在第二轮PCR中，需要考虑三个因素

（i）单链模板中限制性位点的存在；

（ii）限制性位点附近的位置序列；

（iii）特异性引物的性质

因为由第一轮PCR反应中得到的目标模板是一段新序列，我们不知道第二轮扩增时限制性位点间的距离，所以，合成了一系列RSD-引物，并且每个都是针对目标基因的特异性引物。同时，一些区域能被被RSD-引物变性的部分修复，而在这个区域中的匹配碱基的数量是不可预计的。还有，RSD-引物和染色体组DNA之间的结合随着时间的变化会有所变化。这些就可以解释为什么引物的浓度和退火温度会随着在从海栖热袍菌（T. maritima）(Fig. 2A)扩增ak时使用RSD-引物的不同而变化。从已经克隆的片段的序列，我们可以看到5’端经常发生错配[QJ12] ，偶尔也会在RSD-引物的3’端的限制性位点上发生(Fig. 3, TME)。然而，这些错配并不影响扩增的效率，这揭示了特异性引物在选择性扩增中的重要性。扩增的强度和特异性取决于特异性引物的性质。当特异性引物不够独立时，可能会在不希望的位点退火，Fig. 2B-a给出几个可能性。在一些例子中特异性引物没有在目标DNA上退火，导致没有生成目标产物，这种情况之下，就应该合成新的引物。

3.7从PCR产物中筛选目标基因

单一引物作用的循环中偶然发现了一个茎环结构的扩增产物，这是因为侧末端重复(Fig. 1)。

茎环结构比混合模板稳定美因茨抑制了指数级的扩增。但是，单引物扩增产物会出现在从粟酒裂殖酵母（S. pombe）扩增cut6的反应中（Fig. 2B-a）。降低退火的温度到42℃，这种非靶标分子很保守。这里面的原因是生产性PCR引物退火和碎片互补末端的非生产自我退火之间的平衡，这出现在每轮PCR反应的退火阶段。在模板和特异性引物之间这个严格的温度是不同的。然而，在大多数情况下，同样大小的片段会出现在不同的RSD-引物扩增反应中。这被看作是非靶标分子的PCR背景。他们很容易的就可以和目标片段区分开来，目标分子常在不同RSD-引物的扩增中呈现不同的大小(Fig. 2B-a).RSD-PCR的主要产物用AK和Nco-dep放大，仅仅得到了两种理论产物的一种，1.6kb的片段(Figs 2A-a and 3)。推测的0.6kb的片段丢失了，这可能是因为ex Taq DNA polymerase[QJ13] 扩增基于长度，RSD-引物对退火温度的偏好取决于模板和引物的序列。

3.8 RSD-PCR的优点和应用

RSD-PCR有以下几个优势：

(i)    染色体DNA直接用于第一轮PCR反应，因此，诸如消化、结合等低效的步骤就回避了；

(ii)   第一轮中的扩增和单链目标模板的稀释，弱化了非靶标DNA的干扰，使通用DNA在未知端的使用成为了可能；

(iii)  两轮PCR的严格条件减少了引物对染色体组DNA的非特异性退火，牢牢的控制了扩增的特异性；

(iv)   RSD-PCR不需要嵌套式PCR的选择，使基因步移的一种有用技术，它使用了基于氨基端氨基酸序列和保守氨基酸序列

RSD-PCR能应用在以下集中情况下的分子克隆：

(i)    从简并引物获得新基因，这些简并引物来自于蛋白质的氨基端氨基酸序列和各种酶分子中的保守氨基酸序列；

(ii)   分泌蛋白或者成熟蛋白质的信号肽或者前导肽基因；

(iii)  基因或者基因簇的常规序列；

(iv)   操纵子或者其相邻基因的全部序列。