2004-07-05 22:07:45纖毛蟲
虛擬的實踐
那天老闆拿著剛收到的《細胞》(Cell)跑進來，指著封面文章問我看了沒有？他說這真是amazing! 在這個基因體時代，有這麼多新的事情，我們真應該想一想可以怎麼做…。 他到底是什麼讀到什麼東西，怎麼如此興奮？會特地急著告訴我，當然是跟我做的題目──纖毛的形成──有關係了，而這兩篇同期刊出有關於纖毛的文章，確實是善用基因體序列的訊息而拓展研究疆界的又一項好範例，就算不玩纖毛的人應該也會覺得有意思。
還是先從纖毛說起。真核細胞的纖毛(cilium)與鞭毛(flagellum)是突出於細胞的微細構造，它們以複雜的微管(microtubule)細胞骨架蛋白為縱向大棟，外面包覆著細胞膜。如果把典型的纖毛橫向切開來，利用電子顯微鏡觀察，可以看到九組微管排列成一圈。這樣的基本結構特徵在悠遠漫長的演化過程仍被保留下來，不管是單細胞的草履蟲或你我的氣管上皮黏膜細胞，看起來都十分類似。因此纖毛鞭毛的研究人員大體上就可以互相援用與分享在不同的模式生物上所得到的知識。
早期的生化分析就顯示出纖毛至少由兩百五十種以上不同樣態的蛋白質所組成，到底這些成分有哪些呢？要簡便快捷，就要利用分子生物技術，從分離基因本身來下手。纖毛有一個特點──它可以用理化方法去除，但是不影響細胞存活，而且細胞知道毛掉了會很快地再生，把纖毛長回來。一般生長狀態下的細胞為了維生與代謝，必定會有一大群基因在活動；纖毛沒了的細胞要急著再生長回來，可以想見除了原本那群活動的基因之外，參與纖毛形成的基因更是必然要大量活化表現，所以人們就可以利用「扣除」 (subtraction)與比較的方法，把細胞進行纖毛再生時活動的基因減掉一般生長狀態時活動的基因，如此剩下的就應該是跟纖毛合成有關，所以異常活躍的基因了。
原則知道了，在實際應用上有不同的方式。幾年前我開始以纖毛為論文題目時，採用的方法是古典又正統的互補DNA扣除法(cDNA subtraction)。DNA上的基因被活化了要產生蛋白必須透過mRNA為媒介，所以我們就分離出一般生長狀態細胞的mRNA，以及除去纖毛後正在生長復元的細胞的mRNA，並經過一些程序把它變成互補DNA。如果兩者有相同重覆的，這些互補DNA就可以互相雜合配對，然後我們把兩者共有、形成配對的除去，剩下來的就是那些在生長纖毛細胞中所特有或異常高量表現的基因了。最後一個一個去測定這些剩下來的互補DNA序列，才知道誰是誰。除這個方法之外，還有一種稱為differential display的技術，利用DNA序列隨機排列的短寡核酸當作引子，以一般生長狀態細胞或是纖毛再生時期細胞而來的互補DNA當作模板來進行PCR反應（註一），然後比較哪些產物是纖毛生長時才多出來的。而現在有了整個基因組序列之後，更可以用時髦熱門又先進的DNA微陣列(DNA microarray)，靈敏且全面地檢測到底那些基因活化了。只是四膜蟲基因體的定序結果尚未正式發表在期刊上，加上纖毛蟲的研究社群畢竟不大，市場商機有限，想要廠商商品化或是有人有足夠的錢來生產專屬纖毛蟲的微陣列晶片，恐怕還得等一等。不過不論如何，這些方法若不是要花上許多勞力時間，就是要投資大筆金錢，而且一定要動手實作，才有結果。
同樣利用扣除比對的概念，這兩篇《細胞》的報告卻新創了另一種扣除法，而且可以不必動手做實驗，至少在篩選尋找的過程中不必到實驗檯前去耍刀動槍。這可能嗎？是的，拜當今生醫研究已進入基因體時代，坐在電腦前從網路上就可以查詢到許多種生物的全基因體資訊所賜，這兩群作者們發明了利用電腦程式來進行虛擬的基因體扣除實驗。這個構想是基於纖毛與鞭毛的型態構造與功能既然可以從複雜多細胞的人類溯及簡單單細胞的纖毛蟲，可見早在當初遠古時代的共同祖先細胞時就有這麼一套纖毛基因，而這套基因在演化過程中仍繼續被留存著，這些生物就靠著共享這套基因的指令而知道要如何形成纖毛鞭毛。另外現今還有些真核生物（像是黴菌蕈類與高等植物等）不會長纖毛或鞭毛，是因這套纖毛基因在演化過程中從基因體中失去了，所以它們也失去了纖毛這種構造。於是這些研究人員就看看人類、果蠅、線蟲、單細胞鞭毛蟲與藻類等幾種具有纖毛鞭毛的生物的基因體中有哪些共有的基因，再看看酵母菌與擬南芥等這些沒有纖毛的生物基因體中又有哪些基因，利用程式去比對，把有纖毛的生物所共有的基因扣去沒纖毛生物也重複擁有的基因，剩下來的就正是具有纖毛生物所獨有的基因了。而且利用電腦比對不同生物的基因體，玩玩數學集合的交集聯集，還可以有精緻一些的比較。比方說：線蟲的纖毛構造只出現在某些感覺神經元細胞的末梢，已特化成不會動的衍生型，所以比較基因體中哪些是其他纖毛生物均有但是線蟲沒有的，這些就可能是參與纖毛擺動有關的基因。又如果蠅的精子與神經元末梢等也各是不同的鞭毛纖毛衍生型，形成的機制也稍有不同，所以藉由資料庫中已知的不同組織基因表現的訊息，互相比對看看哪些可能的纖毛基因在哪種組織中活動，就可以透露出到底是哪幾個基因可能負責產生不同纖毛衍生型各自特化的功能。最後利用這些電腦比較得到的結果，研究人員開始真正鎖定幾個目標去作實驗，以驗證預測的可信度．
記得三年前解讀人類全基因體序列的主導人物之一J. Craig Venter來演講時曾提到：今後科學家作研究應該要先去電腦前，從事資料的分析，然後設計實驗，最後才到實驗檯上去動手實證（註二）。雖然動手實作來獲取實驗結果仍是最關鍵重要的一環，而且不管怎麼推理預測，生命現象的解釋總是要有實驗來檢驗與背書，但是運用基因體訊息配合電腦運算，還真是開啟另一種入手研究的途徑。熱門新方法不能完全取代既有的模式，但是新途徑卻可以拓展新疆界，怎不令人興奮！Venter的倡言有人落實了，下一步呢？──在這個基因體時代，有這麼多新的事情，我們真應該想一想可以怎麼做…。我可以體會老闆為何有此感想了。
註一：請參閱「不簡單的簡單」一文。
註二：請參閱「解讀人類基因組的人(三)：成者為王，敗者為寇？」
註三：這兩篇刊在今年五月份《細胞》的文章是
T. Avidor-Reiss et al. (2004). Decoding Cilia Function: Defining Specialized Genes Required for Compartmentalized Cilia Biogenesis. Cell 117, 527-539.
J.B. Li et al. (2004). Comparative Genomics Identifies a Flagellar and Basal Body Proteome that Includes the BBS5 Human Disease Gene. Cell 117, 541-552.
附圖就是該期的封面。
還是先從纖毛說起。真核細胞的纖毛(cilium)與鞭毛(flagellum)是突出於細胞的微細構造，它們以複雜的微管(microtubule)細胞骨架蛋白為縱向大棟，外面包覆著細胞膜。如果把典型的纖毛橫向切開來，利用電子顯微鏡觀察，可以看到九組微管排列成一圈。這樣的基本結構特徵在悠遠漫長的演化過程仍被保留下來，不管是單細胞的草履蟲或你我的氣管上皮黏膜細胞，看起來都十分類似。因此纖毛鞭毛的研究人員大體上就可以互相援用與分享在不同的模式生物上所得到的知識。
早期的生化分析就顯示出纖毛至少由兩百五十種以上不同樣態的蛋白質所組成，到底這些成分有哪些呢？要簡便快捷，就要利用分子生物技術，從分離基因本身來下手。纖毛有一個特點──它可以用理化方法去除，但是不影響細胞存活，而且細胞知道毛掉了會很快地再生，把纖毛長回來。一般生長狀態下的細胞為了維生與代謝，必定會有一大群基因在活動；纖毛沒了的細胞要急著再生長回來，可以想見除了原本那群活動的基因之外，參與纖毛形成的基因更是必然要大量活化表現，所以人們就可以利用「扣除」 (subtraction)與比較的方法，把細胞進行纖毛再生時活動的基因減掉一般生長狀態時活動的基因，如此剩下的就應該是跟纖毛合成有關，所以異常活躍的基因了。
原則知道了，在實際應用上有不同的方式。幾年前我開始以纖毛為論文題目時，採用的方法是古典又正統的互補DNA扣除法(cDNA subtraction)。DNA上的基因被活化了要產生蛋白必須透過mRNA為媒介，所以我們就分離出一般生長狀態細胞的mRNA，以及除去纖毛後正在生長復元的細胞的mRNA，並經過一些程序把它變成互補DNA。如果兩者有相同重覆的，這些互補DNA就可以互相雜合配對，然後我們把兩者共有、形成配對的除去，剩下來的就是那些在生長纖毛細胞中所特有或異常高量表現的基因了。最後一個一個去測定這些剩下來的互補DNA序列，才知道誰是誰。除這個方法之外，還有一種稱為differential display的技術，利用DNA序列隨機排列的短寡核酸當作引子，以一般生長狀態細胞或是纖毛再生時期細胞而來的互補DNA當作模板來進行PCR反應（註一），然後比較哪些產物是纖毛生長時才多出來的。而現在有了整個基因組序列之後，更可以用時髦熱門又先進的DNA微陣列(DNA microarray)，靈敏且全面地檢測到底那些基因活化了。只是四膜蟲基因體的定序結果尚未正式發表在期刊上，加上纖毛蟲的研究社群畢竟不大，市場商機有限，想要廠商商品化或是有人有足夠的錢來生產專屬纖毛蟲的微陣列晶片，恐怕還得等一等。不過不論如何，這些方法若不是要花上許多勞力時間，就是要投資大筆金錢，而且一定要動手實作，才有結果。
同樣利用扣除比對的概念，這兩篇《細胞》的報告卻新創了另一種扣除法，而且可以不必動手做實驗，至少在篩選尋找的過程中不必到實驗檯前去耍刀動槍。這可能嗎？是的，拜當今生醫研究已進入基因體時代，坐在電腦前從網路上就可以查詢到許多種生物的全基因體資訊所賜，這兩群作者們發明了利用電腦程式來進行虛擬的基因體扣除實驗。這個構想是基於纖毛與鞭毛的型態構造與功能既然可以從複雜多細胞的人類溯及簡單單細胞的纖毛蟲，可見早在當初遠古時代的共同祖先細胞時就有這麼一套纖毛基因，而這套基因在演化過程中仍繼續被留存著，這些生物就靠著共享這套基因的指令而知道要如何形成纖毛鞭毛。另外現今還有些真核生物（像是黴菌蕈類與高等植物等）不會長纖毛或鞭毛，是因這套纖毛基因在演化過程中從基因體中失去了，所以它們也失去了纖毛這種構造。於是這些研究人員就看看人類、果蠅、線蟲、單細胞鞭毛蟲與藻類等幾種具有纖毛鞭毛的生物的基因體中有哪些共有的基因，再看看酵母菌與擬南芥等這些沒有纖毛的生物基因體中又有哪些基因，利用程式去比對，把有纖毛的生物所共有的基因扣去沒纖毛生物也重複擁有的基因，剩下來的就正是具有纖毛生物所獨有的基因了。而且利用電腦比對不同生物的基因體，玩玩數學集合的交集聯集，還可以有精緻一些的比較。比方說：線蟲的纖毛構造只出現在某些感覺神經元細胞的末梢，已特化成不會動的衍生型，所以比較基因體中哪些是其他纖毛生物均有但是線蟲沒有的，這些就可能是參與纖毛擺動有關的基因。又如果蠅的精子與神經元末梢等也各是不同的鞭毛纖毛衍生型，形成的機制也稍有不同，所以藉由資料庫中已知的不同組織基因表現的訊息，互相比對看看哪些可能的纖毛基因在哪種組織中活動，就可以透露出到底是哪幾個基因可能負責產生不同纖毛衍生型各自特化的功能。最後利用這些電腦比較得到的結果，研究人員開始真正鎖定幾個目標去作實驗，以驗證預測的可信度．
記得三年前解讀人類全基因體序列的主導人物之一J. Craig Venter來演講時曾提到：今後科學家作研究應該要先去電腦前，從事資料的分析，然後設計實驗，最後才到實驗檯上去動手實證（註二）。雖然動手實作來獲取實驗結果仍是最關鍵重要的一環，而且不管怎麼推理預測，生命現象的解釋總是要有實驗來檢驗與背書，但是運用基因體訊息配合電腦運算，還真是開啟另一種入手研究的途徑。熱門新方法不能完全取代既有的模式，但是新途徑卻可以拓展新疆界，怎不令人興奮！Venter的倡言有人落實了，下一步呢？──在這個基因體時代，有這麼多新的事情，我們真應該想一想可以怎麼做…。我可以體會老闆為何有此感想了。
註一：請參閱「不簡單的簡單」一文。
註二：請參閱「解讀人類基因組的人(三)：成者為王，敗者為寇？」
註三：這兩篇刊在今年五月份《細胞》的文章是
T. Avidor-Reiss et al. (2004). Decoding Cilia Function: Defining Specialized Genes Required for Compartmentalized Cilia Biogenesis. Cell 117, 527-539.
J.B. Li et al. (2004). Comparative Genomics Identifies a Flagellar and Basal Body Proteome that Includes the BBS5 Human Disease Gene. Cell 117, 541-552.
附圖就是該期的封面。