CCR6 功能的探討
生醫所助研究員 廖楓

在19 世紀，病理學家即發現白血球(leukocytes) 可以從血液中穿過微血管壁，聚集在組織受傷的地方，這種現象，病理學家稱為“diapedesis”。後來俄國科學家Elias Metschnikoff （1908 年諾貝爾醫學 獎得主）用實驗證明這些白血球聚集在受傷組織的主要目的是要吞噬及嗜殺凝聚在受傷組織的細菌。 所以，diapedesis 被認為是主體防禦(host defense) 的一個基本機制。接下來要問的問題是：白血球如何能知道他們必須要游走到組織受傷的地方呢？這個指引白血球到組織受傷處的任務就由“classical” chemoattractants 及chemokines 來擔當了。 “classical” chemoattractants 包括了fMLP (N-formyl- methionyl-leucy-lphenylalanine), C5a, leukotriene B4 以及PAF (platelet-activating factor)。這一類chemoattractants 主要是作用在 phagocytic cells ，例如neutrophils 。近十年來另外一系列的leukocyte chemoattractants 相繼被發現， 由於他們的氨基酸序列有其特定性，所以自成一家族，此一家族乃稱為chemokines 。Chemokine 這個名詞的由來，是由二個字衍生而來的，即 chemoattractant 的字首加上cytokine 的字尾而形成的。這個名詞其實才在1992 年第三屆International Symposium of Chemotactic Cytokines 的會議正 式給予命名。Chemokine 與classical chemoattractant 不同的地方除了在它們結構上不同外，它們作用的細胞也不同。Classical chemoattractant 主要是作用在phagocytic cells ，而 chemokine 可以作用的細胞除了phagocytic cells 之外，還包括免疫細胞(lymphocytes)以及dendritic cells 。免疫系統可以簡單的分成二類，一類即所謂的Innate （或nonspecific ）immunity ，此系統的主角是phagocytic cells ，另一類是所謂的Adaptive （或acquired, specific ）immunity ，參與此反應的主角是lymphocytes 及dendritic cells 。基於作用的細胞在這二種免疫系統所扮演的角色來看，classical chemoattractants 主要與innate immunity 有關。反觀chemokines ，由於其作用的細胞包括phagocytic cells 及lymphocytes ，所以它的功能有如連接innate及adaptive immunity 的一座橋樑，使得innate 與 adaptive immunity 可以互相溝通，而不是獨立作業。由此可想而知，chemokines 參與免疫反應 (immune response)及發炎反應(inflammatory response)，所以chemokines 在主體防禦(host defense)佔有極重要的角色。雖然chemokines 在免疫及發炎反應扮演著重要角色，而且與許多傳染疾病有關，但是chemokine 一直未受到重視。一直到 1996 ，有些chemokine receptor 被發現是HIV 的co-receptor ，此研究對HIV 研究領域而言，是一項重大的突破，從此chemokine 及chemokine receptor ， 一下從極冷門變為極熱門的研究題材。愈來愈多的研究顯示，chemokines 及chemokine receptors 的 功能除了在引導白血球到受傷組織處外，還擔負許多重要的生理功能，例如lymphocyte homing, lymphoid organ development, lymphoid organ homostasis, angiogenesis 等等。

前面已提過，chemokines 自成一家族，基於 chemokines 的氨基酸序列中的invarant cysteine, chemokines 可再被分成四組：(1)CXC chemokine -IL- 8 即為此組最具代表性的分子，(2)CC chemokine - 其中RANTES, MIP1 , MIP1 比較受囑目，因為它們可以干擾HIV 進入T 細胞，(3)CX3C 及(4)C ；其中(3)及(4)各只有一成員，大部份已知chemokines 都落在(1)及(2)組。至今約40 多種chemokines 已被發現，由於“Silicon cloninig”(Bioinformatics)的風靡， 相信短時間內，此數目尚會繼續增加。Chemokine 的 receptor 是一種seven transmembrane domain G-protein coupled receptor ，由於它們的氨基酸序列也有一定的特性，所以chemokine receptor 也自成一家族，與其他seven transmembrane domian G-protein coupled receptor 有所區別。在1996 年Gordon Conference on Chemotactic Cytokines 的會議中訂 出chemokine receptor 的命名原則；一旦receptor 的 ligand 被找到後，依receptor 被發現的先後順序，給予正式命名。譬如，IL-8 的receptor 是第一個被報告的 chemokine receptor 而且IL-8 是屬於CXC chemokine ，所以就被命名為CXCR1 。至今共有18個chemokine receptor 已被定義出，包括5 個CXC chemokine receptor (CXCR)，CXCR1 - CXCR5 ； 11 個CC chemokine receptor (CCR)，CCR1 -CCR11; CX3CR1 以及XCR1 。Chemokine receptor 的數目必然會迅速地繼續增加，因為目前還有許多 orphan receptors ，它們的氨基酸序列像chemokine receptors ，而且有許多chemokines 也還一直在尋找它們的receptor 。

由於我對於表現在淋巴細胞(lymphocytes)的 chemokine receptor 有相當的興趣，所以幾年前決定 clone 表現在淋巴球上的chemokine receptor 。在那個時候，genome project 尚在初期階段，沒有所謂的 “Silicon cloning” (Bioinformatics)，再加上當時已知的chemokine receptors 相當少，所以我就用很傳統 clone G-protein coupled receptor 的方法－那就是 degenerate PCR ，找出新的類似chemokine receptor 的sequences ，然後再製造TIL (Tumor infiltrating lymphocytes)的cDNA library 以便得到完整的 sequence ，我總共得到2 個新的類似chemokine receptor 的genes ，我給予命名STRL22 及STRL33 （seven transmembrane domain receptor from lymphocytes ，clone 22 及clone 33 ）。其中STRL22 ，由於其ligand-MIP3a被找到了，所以不再是orphan receptor ，而重新給予正式命名，CCR6 。 STRL33 至今仍是orphan receptor ，由於我的研究及其他人的研究顯示STRL33 是HIV 及SIV 的co-receptor ，所以STRL33 雖然是個orphan receptor ， 但是對於從事HIV 研究者而言，他們對此分子有著相當大的興趣。

從clone CCR6 ，到找尋CCR6 的 ligand-MIP3a ，到研究CCR6 的表現及功能，在這研究過程中，我發現到許多值得深入探討的課題，所以目前研究工作的主角就是CCR6 。在談目前研究方向以前，我想先把CCR6 的一些特異性做一個簡單的介紹。為了探討CCR6 的表現及功能，我們製造 CCR6 的抗體，利用這抗體，我們發現到CCR6 有下列特殊的現象：(1)CCR6 主要表現在淋巴組織 (lymphoid tissue)，至於白血球群(leukocyte population)，CCR6 只表現在淋巴球(T and B lymphocytes)及dendritic cells 啟動免疫反應的三種主要細胞；(2)CCR6 與其ligand(MIP3a)之關係是非常專一的(monogamous)，不像大多數的CC chemokine receptors ，他們總有一個以上的 ligands; (3)CCR6 在染色體的位置是在6q27 ，也有別於大多數CC chemokine receptors 的位置 (3p21);(4)CCR6 在T 細胞的表現是不受T 細胞的活化所影響，而且CCR6 只表現在memory T 細胞。值得注意的是，大部份表現CCR6 的T 細胞同時又表現a4b7integrin ，此分子乃是引導淋巴球進入 intestine-associated lymphoid tissue ；(5) CCR6 在B 細胞的功能與在T 細胞的功能是有所不同的。CCR6 雖然表現於B 細胞，但是B 細胞郤對MIP3a沒有反應；然而，一旦B 細胞被活化後，被活化的B 細胞就開始對MIP3a 有反應了。綜合CCR6 這些特性，我相信CCR6 在發炎組織中主要是扮演著啟動 “memory”免疫反應的角色，尤其對intestine-associated immnue response 更為重要，所以 CCR6/MIP3a 可能與腸道的傳染病極有關係。

目前的研究方向可分為三方面：(1)了解CCR6 的分子結構與其功能的相關性；(2)探討CCR6 的分子傳訊(signal transduction)；(3)探討CCR6 在 intestinal mucosal immunity 所扮演的角色。由於 CCR6 與其ligand (MIP3a) 的相互作用仍未被闡述， 而且由我先前的工作得知，CCR6 的ligand binding 並不在於N-terminus ，所以我推測CCR6 的ligand binding 位置可能在於其他的extracellular domain (ECD)，例如ECD-1, ECD-2, ECD-3 或是其間的組合。。為了要了解那一個或那幾個ECD 是負責CCR6 的ligand binding 及其功能反應，利用overlapping PCR 的方法把CCR6 的ECD 換成CCR5 的ECD ，然 後再進一步去分析這些chimera 對於MIP3a 的 binding 及對於MIP3a 的反應，以期能定義出那一個 （或那幾個）ECD 是與ligand binding 有關或與其功能反應有關。此外，為了要用小鼠當實驗動物，我也clone 小鼠的CCR6 及 MIP3a 。當我比對人的 CCR6 及鼠的CCR6 時，發現某些氨基酸是非常地 conserved ，而且這些conserved 的氨基酸是其他 chemokine receptor 所沒有的，可見這些氨基酸對 CCR6 而言是極具特異性。所以我把這些氨基酸做 site-directed mutation ，然後再分析這些CCR6 mutants 對 MIP3a的binding 及對MIP3a的反應。希望能了解到是否這些氨基酸對於CCR6 的ligand binding 及功能有所影響。其次的目標是探討CCR6 的signal transduction ，一般而言，chemokine receptor 的signal transduction 還是處於萌芽期。我希望能深入探討CCR6 的signal transducing pathway 。研究的方向將會放在找出與CCR6 intracellular domain (ICD) 相互作用的分子並探討其作用的機制，這包括了，G-protein, G-protein 的regulators ，例如GRK (G-protein receptor kinase)及最近被報導的RGS (Regulators of G-protein signaling)。接著再進一步找出下游的 signaling molecules ，以期能定義出CCR6 的 signaling pathway 。前面已提過，我先前的研究顯 示B 細胞的CCR6 是沒有反應的，除非B 細胞要先被活化。這暗示著B 細胞經由B space cell antigen receptor (BCR) 的活化導致於CCR6 的活化。BCR 的signaltransduction 是由tyrosine phosphorylation 來調控的，而CCR6 的signal transduction 是由G-protein 來調控的。探討這二條 signal transduction pathway 如何互相cross-talk 是研究目標之一。

最後我希望能進一步探討在gut-associated immune response 所扮演的角色及CCR6/ MIP3a在gut-associated inflammatory disease 所扮演的角色。Chemokine 是一種可分泌性的小分子 (secreted, small molecular, 8-10 kd)，因此很容易被應用在臨床治療上。基於此理由，世界上許多知名的 pharmaceutical companies 都提供大量的資源及人力從事這方面的研究，以期研發出治療傳染病的藥物，我希望藉著對CCR6/MIP3a的研究，能提供一些訊息，對發展治療傳染病的藥物，及對了解與腸道有關的傳染病之機轉能有所幫助。

轉眼之間，加入生醫所的行列也屆滿一年，因到生醫所報到的時候（八十八年一月），正值新舊大樓實驗室搬遷及交接等事宜，故遲遲未能有專屬的實驗室，直到四月底始有實驗室空出後，才開始著手建立實驗室。至今，一切大概皆已就緒，日漸步上軌道。在此我要感謝生醫所給予各方面的支持與協助；尤其是助理－艾麗霜小姐，在草創實驗室之際，給予的莫大幫忙及助力。